Каждый подвальный этаж в The Binding of Isaac представляет собой набор комнат одинакового размера (блоки 13×7). Комнаты генерируются случайным образом, а это значит, что за каждой дверью скрывается множество монстров, препятствий или бонусов. Часть уровня, которая уже была исследована, всегда отображается на карте в верхней левой части экрана.
Помимо монстров, в обычной комнате могут быть каменные препятствия, шипы, пропасти, мусорные кучи, сундуки и предметы. В каждой из этих комнат игрок должен уничтожить всех врагов, за что он получает вознаграждение в виде обычного предмета (сердце, монета, ключ или бомба), и пропуск, в виде открывающейся двери в соседние комнаты.
На каждом уровне также есть специальные комнаты (обозначены значками на карте):
Комната с объектом
Находится за золотой дверью (чтобы открыть ее, нужен ключ), отмеченной на карте желтым цветом. В комнате нет ни противников, ни препятствий, только ценный предмет на специальном постаменте в центре.
Торговый зал
Находится за деревянными дверями (чтобы открыть их, нужен ключ), отмеченными на карте монеткой. В этой комнате игрок может купить от трех до пяти различных предметов, выбранных игрой случайным образом. Цены варьируются от 3 до 15 монет. Иногда товары могут продаваться за полцены (цена будет выделена красным цветом). Иногда вместо магазина можно получить доступ к мини-боссу.
Зал испытаний
Находится за решетчатой дверью с двумя скрещенными мечами. Он будет открыт только в том случае, если игрок полностью здоров. Внутри, в центре, находится сундук. Открыв сундук, игроку придется отбиваться от трех волн врагов. После уничтожения всех врагов откроется дверь в комнату.
Игровая комната
Находится за закрытой дверью (для открытия которой требуется монета) с надписью «Аркада». На карте она представлена красным игровым кубиком. В комнате есть три мини-игры: автомат «однорукий бандит», автомат для сдачи крови и игра в наперстки.
 | Игровой автомат. При каждом использовании требует монету, за которую игрок может выиграть бомбу, ключ, монету, таблетку, муху. Есть небольшой шанс выиграть джекпот — долларовый предмет (+99 монет). |
 | Наперстки. Вы должны заплатить монету, чтобы сыграть в игру в наперстки, вы можете выиграть бомбу, ключ или специальный предмет Skatole (мухи не наносят урона). Нет смысла следить за тасовкой, анимация всегда одна и та же, вам остается только надеяться, что вам повезет. |
 | Автомат для сдачи крови (донорская машина). Забирает половину вашего сердца и дает взамен 1, 2 или 5 монет (на уровнях Womb добавляет сразу целое сердце). Если вы используете одну из этих машин около 10 раз, она сломается, и из нее выпадет мешок крови (+1 здоровье на максимум). |
Тайная комната
Не имеет видимого входа и не отмечена на карте (когда открыта, отмечена знаком вопроса). Секретная комната находится за пределами уровня, но обязательно граничит с 3-4 видимыми комнатами (очень часто с магазином). Найти тайные комнаты помогут следующие предметы: компас, карта, рентгеновские очки, шахтерская каска.
Чтобы попасть в секретную комнату, игрок должен взорвать бомбу в центре стены, граничащей с предполагаемым местом расположения комнаты. Внутри может быть 6-9 монет, редкий предмет и иногда игровой автомат.
Комната с мини-боссом
Обозначен на карте как серая голова. В этой комнате находится один из семи мини-боссов (отсылка к семи смертным грехам).
Комната босса
Находится за большими дверями с черепом. На карте она изображена в виде черепа. Эта комната является выходом с уровня. Внутри находится босс. После его уничтожения выпадет несколько сердец и предмет на постаменте, а самое главное – откроется дверь-ловушка в полу, ведущая на следующий уровень. Время от времени может появляться дверь в комнату дьявола.
Комната дьявола
Иногда появляется после победы над боссом. Невидимый на карте уровня. Так же, как в магазине, только платить нужно не монетами, а максимальным уменьшением здоровья (если будет потрачено все здоровье, герой умрет). Именно в этой комнате вы можете купить самые мощные предметы в игре.
Комната — ошибка
Она не является частью уровня и может быть открыта только с помощью предмета «телепортатор». Внутри находится человек с надписью «I AM ERROR» (отсылка к игре Zelda II для NES). Комната представляет собой обычный магазин, но с более редкими предметами.